细胞在-80℃条件下的保存基于低温生物学的原理。低温可以显著降低细胞代谢速率，减少细胞内生化反应的进行，从而延长细胞的存活时间。
二、细胞保存的实践指南
1. 准备工作
仪器和耗材：准备超净工作台、离心机、水浴锅、倒置显微镜、程序冻存盒、冰箱及液氮。准备3ml移液管、15ml离心管、T25培养瓶、冻存管、酒精灯、废液缸等。
试剂：准备基础培养基/完全培养基、血清、抗生素、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、冻存液、PBS等。
移除旧培养基：吸去旧的培养基，使用5ml PBS溶液洗细胞1-2次。
消化细胞：加入1-2ml 0.25%含EDTA的胰蛋白酶，轻轻晃动培养瓶/皿，等待2-3分钟。
准备冻存管：在外表面做好标记，包括细胞系名称、实验组名称、操作日期等。
终止消化：倒置显微镜下观察细胞明显变圆、变亮且细胞间隙增大，加入4ml培养基终止消化。
细胞离心：将细胞悬液转移到15ml离心管中，1000r/min离心5分钟。
重悬细胞：吸弃上清液，加入1ml的冻存液重悬细胞，轻轻吹打形成单细胞悬液。
冻存：拧紧管盖，用封管膜封口后放入冻存盒，放入-80℃冰箱过夜，然后转移至液氮长期保存。
收集细胞悬液：收集细胞悬液转移至15ml离心管中，以1000r/min离心5分钟。
准备冻存管：在外表面做好标记。
重悬细胞：吸弃上清液，加入1ml的冻存液重悬细胞，轻轻吹打形成单细胞悬液。
冻存：拧紧管盖，用封管膜封口后放入冻存盒，放入-80℃冰箱过夜，然后转移至液氮长期保存。
在冻存之前，确保细胞状态良好，包括细胞生长密度、无污染、形态良好等。DMSO可以溶解部分滤膜，如果要进行过滤，应选择不会被DMSO降解的滤器，并且操作时务必带手套。
冻存密度应该比传代时高得多，等到了复苏后，再将密度稀释为1/20也依然能保持较高的生长密度，但与此同时，残留的DMSO对细胞的影响则会大大降低。
以上流程适用于大多数细胞的冻存，操作时应注意细节，以确保细胞冻存的成功率和细胞活力。
细胞密度和冻存液：
冻存速率和保护措施：
冷冻保护剂的使用：
避免室温解冻：
冻存管的安全操作：
通过遵循这些实践指南，科研人员可以有效地保存细胞，确保细胞在-80℃冰箱中的长期稳定性和活力。
三、细胞保存的期限和影响因素
保存期限：理论上，细胞在-80℃的条件下可以保存数十年。然而，实际保存期限受多种因素影响，包括细胞类型、冻存和复苏技术、冻存液成分等。
四、如何快速检测细胞复苏后的活力？
台盼蓝染色法：常见死细胞鉴定方法之一。正常情况下，细胞能排斥这种活性染料而不被染色；但细胞活性丧失或胞膜不完整时，台盼蓝可以穿过变性的胞膜，与DNA结合，使其染为蓝色。此为鉴定台盼蓝死细胞原理。与细胞凋亡检测类似 细胞凋亡实验学习笔记，只是染料不同，并且步骤操作及检测手段均较为便捷。可以做一个快速的判断。荧光染色法：使用荧光染料，如Calcein-AM或CFSE，这些染料在活细胞内被代谢成荧光产物，通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。一旦进入细胞，它会被细胞内的酯酶水解成DCFH。由于DCFH无法穿过细胞膜，因此荧光探针会在细胞内积聚。细胞内的ROS能够氧化无荧光的DCFH，生成有荧光的DCF，且荧光强度与ROS水平成正比。通过荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等设备，在最大激发波长480nm和最大发射波长525nm下检测荧光信号。ATP检测法：基于细胞内ATP含量与细胞活力成正比的原理，通过检测ATP的增加水平可以反映出细胞增殖情况。当 ATP 接触到荧光素酶后，就会发生反应产生出光，物体表面残留的食物和微生物越多，ATP 也就越多，发出的荧光也就越强。CCK-8检测：这是一种基于WST-8检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测法，主要用于细胞活性检测。WST-8在电子耦合试剂存在的情况下，可被线粒体内的一些脱氢酶还原成Formazan（橙黄色）。选择适合的检测方法时，需要考虑实验的具体需求、细胞类型以及实验室设备的条件。这些方法可以单独使用，也可以组合使用以获得更准确的细胞活力评估。
细胞冻存液中DMSO的比例通常是多少？
在细胞冻存过程中，二甲基亚砜（DMSO）作为一种常用的冷冻保护剂，其比例通常控制在5%到10%之间，以确保细胞在冷冻和解冻过程中的存活率。DMSO的作用是降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。对于大多数细胞类型，一个常见的冻存液配方是将培养基、血清和DMSO按照7:2:1的比例进行配制。然而，对于存活率较低的细胞系或需要长时间保存的细胞系，可能需要增加冻存液中的血清浓度，血清和DMSO的比例可以调整为9:1。此外，还有一些无血清冻存液的选择，这些冻存液不需要预先配制，通常含有多种保护剂成分，适用于特别珍贵的细胞的保存，例如干细胞、分离后的免疫细胞等。在实际操作中，科研人员应根据细胞类型和实验需求，精心设计冻存条件，以提高细胞保存的成功率。
