一、污染的“真面目”
要打败敌人，首先得了解敌人。细胞培养中的污染主要分为生物污染和化学污染两大类，其中生物污染最为常见，也最让人防不胜防。
1、细菌污染
细菌是细胞培养中最常见的“入侵者”。它们个头小、繁殖快，一旦混入培养体系，短时间内就能大量增殖。污染初期，可能只是培养基稍微变浑浊，随着细菌数量的增加，培养基会迅速变黄、变浑浊，甚至散发出异味。在显微镜下观察，能看到大量微小的点状颗粒，它们有的做布朗运动，有的呈直线型快速移动。受到细菌污染的细胞，生长会变得缓慢，形态也会发生改变，严重时会贴壁能力下降、皱缩直至死亡。 细菌污染的来源十分广泛，可能是实验室环境不洁、实验人员操作不规范、试剂或耗材灭菌不彻底等。比如，超净台紫外消毒时间不够，操作时没有佩戴无菌手套，或者培养基开封后没有妥善保存，都可能让细菌有机可乘。
2、真菌污染
真菌污染就像“潜伏者”，初期很难被发现。它们通常以少量白色、黄色或绿色霉斑的形式附着在培养基表面或培养瓶内壁，后期霉斑会逐渐扩大，菌丝可能蔓延至整个培养体系。虽然培养基可能保持澄清，但真菌的代谢产物会抑制细胞生长，导致细胞增殖缓慢、形态异常。 真菌污染多发生在环境湿度较高的场景，比如夏季梅雨季节。培养箱长期不清洁、培养瓶瓶口长期敞开、实验后操作台残留试剂没有及时清理等，都容易滋生真菌。
3、支原体污染
支原体是细胞培养中最隐蔽的“杀手”。它们体积微小，普通光学显微镜下难以直接观察，而且能通过0.22微米的滤膜，常用的双抗（青霉素、链霉素）对它们也无可奈何。污染初期，培养基通常没有明显变化，只是细胞生长状态逐渐变差，比如增殖速率下降、形态不规则、贴壁松散。长期污染会导致细胞生物学特性改变，直接影响实验结果的准确性。 支原体污染的来源主要有细胞株本身、血清、实验操作等。引入新细胞时没有进行支原体检测，使用了质量不合格的血清，或者不同细胞株交叉使用耗材，都可能导致支原体污染。
4、其他污染
除了上述生物污染，细胞培养中还可能遇到化学污染和细胞交叉污染。化学污染主要来自培养基、血清和水中的杂质，比如内毒素、增塑剂和洗涤剂等，这些物质会影响细胞的正常生长。细胞交叉污染则是指不同细胞株之间相互污染，导致细胞不纯，这种污染一旦发生，后果十分严重，可能会让实验结果完全失去意义。
二、污染的“入侵路线”
了解了污染的类型，我们再来看看污染是如何进入细胞培养体系的。只有找到“入侵路线”，才能从源头进行防控。
1、空气传播
空气是微生物传播的最主要途径。实验室环境中的空气如果含有大量微生物，在操作过程中就可能随着气流进入培养体系。比如，超净工作台的滤板没有定期更换，无菌室内人员走动过多，或者外界气流过强，都可能导致空气污染。
2、器材和试剂污染
各种培养器皿、器械清洗不彻底，或者培养用品（如培养基、血清、胰酶等）灭菌消毒不彻底，都可能引入污染物。CO₂培养箱由于湿度大、温度适宜，一旦不慎将培养液漏出，就容易滋生细菌和真菌，如果不定期消毒，会成为污染的“重灾区”。此外，品质没有保证的血清在生产时就可能被支原体或病毒污染，添加到细胞培养液中后，会直接导致细胞污染。
3、操作不规范
无菌操作不规范是导致细胞污染的重要原因之一。实验人员在操作前没有对手部和台面进行充分消毒，操作时说话、咳嗽，或者使用了污染的器械，都可能将微生物带入培养体系。另外，培养两种以上细胞时，如果没有做好隔离措施，还会发生细胞交叉污染。
4、取材污染
取材时操作不当也会导致微生物污染。比如，取材的动物组织标本本身带有细菌，或者取材时没有使用较浓的抗生素浸泡清洗，都可能让污染“从源头开始”。此外，外科手术时使用碘酒消毒，若不慎将碘混入样本，也会影响细胞生长。
三、让细胞“安居乐业”的防护秘籍
既然知道了污染的类型和入侵路线，我们就可以采取针对性的措施，为细胞打造一个安全的“家”。
1、筑牢“无菌防线”，从源头防控
- 严格无菌操作：实验前，超净工作台要进行至少30分钟的紫外消毒，操作前用75%酒精消毒双手及台面。操作时要佩戴无菌手套、口罩，避免手部接触耗材的无菌区域，尽量靠近酒精灯火焰进行操作，减少空气流动带来的污染。实验结束后，要及时清理操作台，将多余的仪器耗材取出，并用75%酒精擦拭台面。
- 使用无菌试剂和耗材：培养基、血清等试剂使用前要检查是否存在浑浊、沉淀等异常，开封后要规范储存并在有效期内用完。实验耗材要选用合格的灭菌产品，使用前确认包装完好无破损。培养基和血清最好进行过滤除菌或高压灭菌处理，培养瓶、培养板等要确保无菌包装。
- 定期监测细胞：每天要观察培养液的颜色、浑浊度及细胞形态，一旦发现异常，及时处理。同时，要定期对细胞进行支原体检测，尤其是引入新细胞时，必须确认合格后再扩大培养。
2、清洁“居住环境”，打造无菌空间
- 超净工作台维护：定期检查超净工作台的滤网，当发现出风口风速减弱时，要立即更换。使用超净工作台时，要提前30分钟开启紫外灯消杀，启动风机后等气流稳定5分钟再进行操作。操作时手臂尽量沿工作台边缘平移，避免在无菌区“挥拳乱舞”，防止气流扰动让细菌趁机进入。
- 培养箱清洁消毒：培养箱是细胞的“家”，必须保持干净整洁。定期用75%酒精擦拭培养箱内壁，包括平板、腔体以及储水槽等。可以根据污染物类型选择不同的灭菌模式，比如干热灭菌或湿热灭菌。同时，要控制培养箱内的湿度，避免培养瓶瓶口长期敞开，防止真菌滋生。
- 实验室环境管理：实验室要保持清洁卫生，定期进行通风换气。无菌室内要减少人员走动，避免大声说话、咳嗽等行为。实验垃圾要及时清理，防止滋生细菌和真菌。
3、精细“日常养护”，增强细胞抵抗力
- 掌握细胞传代时机：不要等细胞长老了再传代，要在细胞生长到汇合度80%-90%时进行传代，这样细胞的状态最好，抵抗力也最强。同时，要掌握好消化时间，防止消化过度产生细胞碎片，影响细胞的正常生长。
- 合理使用血清和培养基：血清是细胞的“营养大餐”，要选用质控严格的血清产品，降低污染概率。培养基要现配现用，如需储存，4℃冰箱保存时间不要超过3天。配制培养基时，所有试剂瓶身要用酒精棉片擦拭，移液枪头严禁二次插入试剂瓶，防止交叉污染。
- 减少试剂冻融次数：血清、培养基等试剂反复冻融会产生蛋白沉淀，影响细胞的生长。因此，要尽量减少试剂的冻融次数，可将试剂分装成小份，每次使用取一份即可。
四、污染后的“急救指南”
万一不幸发生了细胞污染，也不要惊慌失措，要根据污染类型和严重程度，采取相应的急救措施。
1、细菌污染急救
如果是轻度污染，且细胞比较珍贵，可以尝试以下方法：吸出培养基，用PBS清洗2-3遍，然后加入含10-20倍双抗的培养基培养12小时，之后正常传代，并用含10倍双抗的培养基继续培养。如果第二代镜下未观察到细菌，第三代则可以用正常培养基培养，传代48小时后无反弹，说明污染已清除。 如果是重度污染，建议直接将污染细胞丢弃，然后对培养箱、操作台等进行彻底消毒，防止污染扩散。
2、真菌污染急救
真菌污染一般比较顽固，若非必要，建议直接丢弃污染细胞，并对细胞房、培养箱、操作台以及器皿和培养液等进行全面消毒。如果细胞非常珍贵，可以在PBS润洗、换液后加入两性霉素B或氟康唑进行处理，但要注意这些药物有细胞毒性，使用后可能会有副作用。
3、支原体污染急救
支原体污染很难彻底清除，如果细胞状态尚可，可以添加支原体抑制剂培养2-3代，观察是否转阴。如果细胞状态很差，建议直接丢弃，避免污染其他细胞。同时，要对培养环境和常用试剂进行全面消毒，防止支原体残留。
4、其他污染处理
如果是化学污染，要及时更换培养基，并用PBS多次冲洗细胞，去除污染物。如果是细胞交叉污染，且细胞没有特别重要的价值，建议直接丢弃。如果细胞比较珍贵，可以尝试通过克隆化筛选等方法，分离出纯净的细胞株，但成功率较低。
五、建立“细胞档案”，保障细胞安全
为了更好地管理细胞，减少污染风险，建议建立细胞库。细胞库分为主细胞库和工作细胞库，当需要做实验时，先从主细胞库中取细胞进行复苏，然后建立工作细胞库。工作细胞库的细胞经实验研究使用后，不能再回流到主细胞库中。在细胞库里，每一个标本都要明确记录细胞的名称、性质、代数及有无污染等信息。同时，要建立规范的检测程序，定期对细胞进行“检菌”及细胞鉴定，确保细胞的纯度和安全性。总之，细胞培养污染虽然是一个常见的问题，但只要我们充分了解污染的类型和来源，严格遵守无菌操作规范，加强日常防护和监测，就能够有效降低污染的发生概率，让细胞在安全的环境中健康生长。希望今天分享的这些知识，能帮助各位科研人员在细胞培养的道路上少走弯路，顺利完成实验研究。以细胞为舟，以创新为帆！讯刊生物愿与所有科研用户携手，共同驶向中国科技的星辰大海！讯刊生物为科研用户带来高效稳定科研工具和技术服务：
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